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本试剂盒采用了一种独特的酶标记方法，其敏感性比普通酶标法有明显提高。用于Western Blotting的免疫学检测，更能体现其优点。不仅能大量地节约一抗，更重要的是使条带更清晰，甚至能检测出普通酶标法无法检测出的微量条带。

DAB是过氧化物酶最重要的显色剂之一，反应产物为不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物，适合于免疫印迹的显色反应。本产品采用特殊配方，具有操作简单，储存稳定，信号灵敏度高，持续时间长，背景低，结果易保存等优点。

• 转印了蛋白样品的NC膜或PVDF膜：通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质抗原，将PAG胶上的蛋白质转印到硝酸纤维素膜（NC膜）或PVDF膜上。
  
• 稀释缓冲液：使用中性稀释缓冲液即0.02M PBS（ZN2950）或0.02M TBS（ZN2975）配制封闭液和抗体稀释液。
  
  • 0.02M PBS(pH7.2～7.6)：1000mL蒸馏水加Na₂HPO₄ 2.8g，NaH₂PO₄ 0.4g，NaCl 8.5g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
    
  • 0.02M TBS(pH7.2～7.6)：1000mL蒸馏水中加Tris 2.42g,NaCl 9g;纯乙酸或浓盐酸调节pH值(7.2-7.6)。
• 洗涤缓冲液：每1000mL中性稀释缓冲液中加入0.5mL Tween20即可。
  
• 一抗：选择适合的一抗，用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体工作浓度为1μg/ml，具体的稀释度取决于特异性的一抗和膜上的抗原的量。
  
• 摇床：膜的封闭、抗体孵育和洗涤都需平稳摇晃，需在摇床上操作。
  
• 相机：记录结果。

• 试剂频繁使用时置4℃，不常使用时置-20℃。显色剂A需置-20℃冷冻保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。
  
• 显色工作液应新鲜配制。

• 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本和分子量标准。
  
• 将蛋白样本转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
  
• 封闭硝酸纤维膜：用封闭蛋白干粉2g，加稀释缓冲液100mL，20～37℃封闭1～2小时。用量以浸没整张膜为准。
  
• 洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜5min,1次。
  
• 配制抗体稀释液：取90mL稀释缓冲液加1g封闭蛋白干粉和10mL浓缩抗体稀释液即可。一抗、二抗均用此稀释液稀释。
  
• 硝酸纤维膜孵育一抗：用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体浓度1μg/ml,20～37℃孵育2小时左右。如果缺乏特异性的条带或阳性不强，应提高一抗的浓度；如果有非特异性的条带，应提高一抗的稀释度。
  
• 用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min。
  
• 硝酸纤维膜孵育二抗：用抗体稀释液稀释相应的酶标二抗，效价1:200～400。37℃孵育一个半小时左右。用户可根据实际染色情况对稀释度做适当调整。
  
• 用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维膜4次，每次5min。
  
• DAB显色:使用DAB显色试剂。按每2mL蒸馏水加显色剂A，B，C各1滴，混匀。
  混匀后加至膜上。室温显色。一般显色1～30min。若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。
  
• 观察，照相。
  备注：可访问百奥莱博网站获取详细的Western blotting流程及全套产品信息。